Tres años más tarde, después de haber participado en numerosas excursiones en busca de ejemplares nuevos para la elaboración de su herbario, realizó una expedición al Amazonas, junto a su compatriota Henry Walter Bates, quien también le acompañaría algún tiempo después hasta el archipiélago malayo, donde permanecieron desde 1854 hasta 1862. Más breve fue su visita a Australia, un continente que le aportó mucha información sobre biogeografía.
En aquellos años investigó la distribución geográfica de los animales y observó que existían diferencias zoológicas fundamentales entre las especies asiáticas y las australianas, de resultas de lo cual estableció el concepto de línea divisoria de Wallace, una linea imaginaria entre las islas malayas de Borneo y las Célebes, que sirve para separar los animales de origen australiano de los de origen asiático. Esta investigación permitió a Wallace elaborar de forma independiente su propia teoría de la evolución, que comunicó a Charles Darwin en 1858, las ideas de ambos fueron publicadas de forma conjunta por la Sociedad Linneana de Londres en 1860.
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